賽默飛 7500定量PCR儀作為分子生物學(xué)領(lǐng)域的核心設(shè)備，憑借其多通道熒光檢測、高精度溫控系統(tǒng)及用戶友好界面，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原檢測及SNP分型等領(lǐng)域。然而，其操作復(fù)雜性要求使用者嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化流程。本文從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作規(guī)范及設(shè)備維護(hù)三方面系統(tǒng)梳理關(guān)鍵注意事項(xiàng)。
 

　　一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：從源頭保障數(shù)據(jù)可靠性

　　1.模板與試劑管理：使用高質(zhì)量DNA/RNA模板，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致降解。RNA樣本需經(jīng)DNase處理并驗(yàn)證cDNA合成質(zhì)量。

　　2.耗材適配性：僅使用ABI認(rèn)證的光學(xué)級八聯(lián)管或96孔板，確保管蓋密封性。凸蓋PCR管因熱蓋接觸不良易導(dǎo)致蒸發(fā)污染，需嚴(yán)格禁用。

　　3.對照設(shè)置：每批次實(shí)驗(yàn)需包含陰性對照（NTC）與陽性對照。技術(shù)重復(fù)建議≥3孔，以降低孔間變異系數(shù)（CV）。

　　二、操作規(guī)范：細(xì)節(jié)決定實(shí)驗(yàn)成敗

　　1.反應(yīng)體系優(yōu)化：根據(jù)引物Tm值調(diào)整退火溫度，SYBR Green法需延長退火/延伸時(shí)間至60秒以確保信號捕獲。標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率應(yīng)介于-3.1至-3.6之間，對應(yīng)擴(kuò)增效率90%-110%。

　　2.加樣與運(yùn)行：加樣后離心去除氣泡，避免熒光信號干擾。反應(yīng)板需平整放置于樣品槽，防止孔位偏移導(dǎo)致熱循環(huán)不均。

　　3.數(shù)據(jù)采集與分析：手動(dòng)調(diào)整基線范圍與閾值線至指數(shù)擴(kuò)增期。某研究通過優(yōu)化基線設(shè)置，將Ct值標(biāo)準(zhǔn)差從0.5降至0.2，顯著提升重復(fù)性。熔解曲線分析可鑒別引物二聚體，確保單峰特異性。

　　三、設(shè)備維護(hù)：延長儀器壽命的關(guān)鍵

　　1.日常清潔：實(shí)驗(yàn)后用70%乙醇擦拭樣品槽，避免熒光污染。每月用洗耳球清除反應(yīng)孔灰塵，污染孔需用90%乙醇浸泡20分鐘后沖洗。

　　2.定期校準(zhǔn)：每月執(zhí)行背景校正，每半年進(jìn)行光學(xué)校準(zhǔn)與反應(yīng)孔位置映射校準(zhǔn)。

　　3.環(huán)境控制：儀器需放置于無強(qiáng)電磁干擾、溫度10-30℃、濕度20%-80%的環(huán)境中。潮濕地區(qū)建議配備除濕機(jī)，防止光學(xué)部件霉變。

　　四、故障排查：快速解決常見問題

　　1.無擴(kuò)增信號：檢查模板質(zhì)量、引物特異性及PCR程序設(shè)置。

　　2.非特異性擴(kuò)增：優(yōu)化退火溫度或改用TaqMan探針。SYBR Green法需結(jié)合熔解曲線分析排除二聚體干擾。

　　3.熒光信號偏低：確認(rèn)染料添加量及熱循環(huán)條件。

　　通過嚴(yán)格遵循上述規(guī)范，ABI 7500定量PCR儀可實(shí)現(xiàn)高精度、高重復(fù)性的數(shù)據(jù)輸出。建議使用者定期參加培訓(xùn)并參考手冊，持續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程。